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微量分光光度計的校準方式

更新時間：2018-10-25 點擊次數：3372

引言微量分光光度計的出現解決了微量樣品采用分光法定性及定量測試的問題。基于此特點，該類儀器被廣泛用于生物、醫學等檢測樣本量并且價格昂貴的領域。微量分光光度計屬于分光光度計類測試儀器，遵循朗伯比爾定律，但較普通的分光光度計還是有很大的改進。隨著儀器使用量的增多，不得不考慮該類儀器的溯源性問題。2015 年相關部門提出并計劃編制該類儀器的校準規范，但至今還未出版正式的國家校準規范。本文針對微量分光光度計的測試原理和功能特點，分別對兩種校準方式進行了探討，并提出了建議。

1 微量分光光度計的測試原理及功能特點微量分光光度計的*之處在于它對測試樣品量的要求非常低，現有的儀器中可測量低為 0.3 μL 的樣品，可以節省非常且昂貴的樣品量。檢測波長范圍 200 ～ 1 000 nm，多數儀器設定了定點測試波長 230 nm、260 nm 和 280 nm，便于 DNA、RNA 和蛋白質的測試。采用發光穩定且不需預熱的氙燈代替鎢燈和氘燈作為光源，壽命更長，光強更大。該類儀器中精度稍高的都在使用電感耦合陣列檢測器（CCD），其光譜范圍、量子效率、信噪比等指標都遠高于光電二極管陣列。使用該類儀器多用其基座檢測模式，該功能是實現微量測試的關鍵技術。即，用微量移液槍吸取樣品滴加在檢測基座上，基座上包埋了一根接受光纖，放下檢測臂與液體接觸，檢測臂上有檢測光纖，應用液體的表面張力在檢測基座和檢測臂之間自動形成標準液柱。液柱高度相當于光程，液柱高度可設定為 0.05 nm、0.1 nm、0.5 nm 等。光源發出的光與普通的分光光度計相比，從點樣到測試完成的時間大大縮短，且省去了清洗比色皿的程序。該檢測基座只需用拭鏡紙擦拭即可。該類儀器可以實現的檢測功能如下：普通的紫外 - 可見分光光度計檢測、DNA/RNA 濃度檢測、蛋白質濃度檢測等。

2 微量分光光度計的校準方法分析通過查閱資料，現有的微量分光光度計普遍具有的技術參數，如表 1 所示。與普通的分光光度計比較，一些基本的技術參數還是比較一致的。但是該類儀器預設了 DNA、 RNA、蛋白質、熒光染料吸光度值與濃度的對應關系，所以可以直接給出這些樣品的濃度值。根據以上技術參數及測試原理，對微量分光光度計的校準就有兩種思路，一是從分光光度計的原理參照普通分光光度計的檢定規程 JJG 178-2007《紫外、可見、近紅外分光光度計》來校準，另一種思路是從該類儀器的測量結果入手，以濃度標準物質來校準其測量值的示值誤差等。下面對兩種思路做分析對比，并給出合理建議。

2.1 以濾光液標準物質進行校準該方法可以參照 JJG 178-2007 進行部分項目的校準。可將波長準確性、波長重復性、吸光度準確性、雜散光等儀器主要關鍵的技術指標列為校準項目。對波長準確性和波長重復性的校準可以使用現有的氧化鈥波長溶液標準物質，該標準溶液在波長 240 ～ 650 nm 范圍有 10 個以上尖銳、峰位明確的吸收峰。吸光度的準確性可以使用 JJG 178-2007 給出的方法，配制一定濃度的重鉻酸鉀高氯酸溶液或重鉻酸鉀硫酸溶液，用高精度的紫外可見風光光度計定值其在 235 nm、257 nm、313 nm、350 nm 處的吸光度值。通常是在光程為 10 mm 定值，使用時可根據朗伯比爾定律 A = - kLc 來轉換更小光程時的吸光度值，當儀器給出的是標準為光程 10 mm 的吸光值時則不需要將標準值換算即可進行比較。其次要注意校準時環境溫度與定值時溫度的匹配性。雜散光特性可以根據 JJG 178-2007 的要求使用 10 g/L 的溶液和 50 g/L 的亞硝酸鈉分別在 220 nm 和 340 nm 處檢測儀器的透光率或吸光度值。以上校準方式和項目是基于微量分光光度計的測量原理，結合生產商給出的技術參數，使用者可以利用校準結果對被校儀器有一個綜合的評價。此外，如果希望進一步了解儀器的基線平直度和基線噪聲等指標也可參照 JJG 178-2007 來制定校準方法。

2.2 以濃度標準物質進行校準該方法是在微量分光光度計可以直接測定核酸和蛋白質類物質的含量值基礎上，以 DNA 標準物質、RNA 標準物質或蛋白質標準物質來測定標準物質的測量值與標注值之差作為儀器的示值誤差來評價儀器的計量特性。該類儀器預設了定點波長測試功能，并且預設了吸光度值與濃度值的關系。核酸和蛋白質的大吸收波長 260 nm、280 nm，為了判斷核酸或蛋白質的純度還增加了 A230 nm 用來表示樣品中存在的一些污染物如碳水化合物、苯酚、多肽等，A320 nm 用來表示樣品的渾濁度和其他干擾因子。用濃度標準物質來校準該類儀器還可以將測量值的重復性和儀器的線性納入校準項目，當然儀器線性的評價需要用到不同濃度的系列標準溶液。 3 結語綜合上述分析，種校準方式在稍加細化的基礎上即可以開展校準工作，且對于廣大的計量工作者來講比較容易上手，標準物質價格較低且容易獲得。而后一種校準方式雖然可以給出微量分光光度計的測量結果的示值誤差、線性等計量特性優劣，但在實際校準過程中如何選定標準物質，僅單一標準物質還是核酸類和蛋白質類共同使用，因為兩者是在不同的吸收波長下進行定量測量，考查的是不同波長下濃度測量的準確性。而且還需要考慮 DNA 或 RNA 標準物質及蛋白紙標準物質的穩定性、經濟性和易獲得性，且對存儲條件的要求不能太高，尤其是有些 DNA 含量標準物質的存儲溫度要求較低，不便于計量工作人員進行現場校準。所以在 JJG 178-2007 的基礎上研制一套系列標準液，對該類儀器的波長準確性、吸光度準確性、雜散光等計量特性進行校準，通過校準結果可以客觀、全面地評價儀器的技術指標，給使用者了解該儀器提供更加綜合的數據。

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