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紫外分光光度計法測定啤酒中的雙乙酰

更新時間：2018-10-25 點擊次數：6297

1 試驗方法分析

1.1 試驗原理雙乙酰測定的原理是采用水蒸氣蒸餾, 使雙乙酰作為揮發性組份從啤酒樣中蒸發出來, 然后加入試劑鄰苯二胺, 反應生成 2 ,3 - 二甲基喹喔啉。在波長 335nm 處有一吸收峰, 可作定量測定。由于鄰苯二胺和 2 ,3 - 戊二酮等均有此反應, 因此, 本法測得的為聯二酮的總量(以雙乙酰表示)。另外, 如樣品中含有雙乙酰甲基甲醇, 也會在蒸餾過程中分解生成雙乙酰, 使測定結果偏高[2] 。

1.2 試驗儀器 1.2.1 帶有加熱套管的雙乙酰蒸餾器;

1.2.2 具有錐形瓶(或平底蒸餾燒瓶)的蒸汽發生瓶: 2000mL(或 3000mL);

1.2.3 容量瓶: 棕色 25mL( 避光) ;

1.2.4 紫外分光光度計: 備有 10mm、20mm、30mm 的石英比色皿或玻璃比色皿。

1.3 試劑和溶液 1.3.1( 4mol/L) 鹽酸溶液: 按 GB/T 601 配制;1.3.2( l0g/L) 鄰苯二胺溶液: 稱取鄰苯二胺 0.100g, 溶于 4mol/L 鹽酸溶液中, 并定容至 10mL, 搖勻, 放于暗處。此溶液須當天配制與使用; 若配制出來的溶液呈紅色, 應重新更換新試劑;

1.3.3 有機硅消泡劑(或甘油聚醚)。

1.4 試驗步驟

1.4.1 蒸餾將雙乙酰蒸餾器安裝好, 加熱蒸汽發生瓶, 使水至沸。通汽預熱后, 置 25mL 容量瓶于冷凝器出口接受餾出液, 外加冰浴冷卻; 加 3 滴消泡劑于 100mL 量筒中, 再注入未經除氣的預先冷至 5℃左右的酒樣 100mL, 迅速移入已預熱的蒸餾器內, 并用少量水沖洗量筒及帶塞漏斗, 蓋塞。然后用水封口, 進行蒸餾, 直至餾出液接近 25mL(蒸餾需在 3～5min 內完成)時取下容量瓶, 達到室溫用水定容, 搖勻。

1.4.2 顯色與測量分別吸取餾出液 10.0mL 于兩支干燥的比色管中, 并于第一支管中加入鄰苯二胺溶液 0.5mL, 第二支管中不加 (做空白), 充分搖勻后, 同時置于暗處放置 20～30min, 然后于支管中加 4mol/L 鹽酸溶液 2mL, 于第二支管中加入 4mol/L 鹽酸溶液 2.5mL, 混勻后, 于 335nm 波長下, 用 20mm 石英比色皿, 以空白調儀器零點, 測定其吸光度。( 比色測定操作須在 20min 內完成, 有條件的此過程好在暗室中進行)

1.5 計算結果試樣中雙乙酰含量按下式計算:式中: X - 試樣中雙乙酰的含量, mg/L; A335 - 試樣在 335nm 波長下, 用 20mm 比色皿測得的吸光度; 1.2- 使用 20mm 石英比色皿時, 吸光度與雙乙酰含量的換算系數。

2 測定結果與討論

2.1 方法精密度的考察通過對啤酒樣品的多次測定( n=6) , 按照公式( 2) 、( 3) 計算方法的相對偏差和變異系數, 考察方法的精密度, 并將方法改進前后兩組測定結果列于表 1、表 2。

2.2 討論 2.2.1 測定誤差眾所周知 , 分光光度計比較適宜的吸光度范圍是 A = 0.2~0.8。但在此法測定雙乙酰含量時, 吸光度的值是很小的, 所以這是造成測定誤差較大的主要原因。因為在正常的工作環境下, 對于一個給定的分光光度計來說, 透光率讀數誤差 △T 是一個常數, 約為 0.01~0.02。而透光率 T 與吸光度 A 之間是對數關系, 同樣大小的△T, 在不同的 A 值時所引起的吸光度的誤差△A 是不相同的。由以下推導可以看出, A 值愈大, △T 引起的△A 愈大。( 以下△T、△A、△X 均為偏差) A = log 1/T = - log T

(4) 由于 A = KX(比耳定律)

(5) △A = K △X

(6) 所以△A/ A = △X/ X

(7) 因此, 當 X 很低時, A 值很小, 這時△T 引起的△A 和△X 也很小, 但因為此時 X 很小, 所以相對偏差△X/ X 是比較大的。設雙乙酰含量為國標(優級)的上限 0.13mg/ L , 按式(1)計算, 相應的吸光度 A = 0.13/1.2 = 0.108 由 A = - log T 得出 T = 0.78 若△T = 0.01 則△A = 0.006 相對偏差△X/ X = △A/A = 0.006/ 0.108 = 5.4 % 事實上, 大多數企業為控制成品啤酒雙乙酰的回升現象, 雙乙酰內控指標是很低的, 一般控制在 0.05mg/ L 左右, 這時, 相應的吸光度 A = 0.042 若△T = 0.01 則△A = 0.005 相對偏差△X/ X = △A/A = 0.005/ 0.042 = 11.9 % 由此可見, 雙乙酰測定結果的精密度較差, 可靠程度較小, 這樣勢必會造成同一樣品平行測定結果的重現性差, 不同實驗室的測定結果就更難比較了。

2.2.2 其他因素對測定結果的影響雙乙酰測定結果往往比實際偏高, 這主要是由于在酵母形成雙乙酰的過程中, 生成一種叫 α- 乙酰乳酸的物質, 這種物質極不穩定能較快地被氧化成為雙乙酰, 也更易干擾雙乙酰的測定, 在啤酒發酵中似乎未檢出這種物質, 它也可能是造成雙乙酰測定偏差的主要原因[3,4] 。

2.2.2.1 取樣取樣前酒樣釋放的量要適量, 取樣要準確, 在取樣的同時, 樣品內存在酵母和空氣以及溫度上升和時間的延長, 都可能直接引起雙乙酰迅速變化, 所以, 我們用紫外分光光度計法測定酒樣或半成品酒樣在取樣的時候, 要盡量多放一些酒樣, 把瓶頸口或管道中酵母雜質沖下去, 這樣取來的酒樣才能較為均勻, 有代表性, 雙乙酰測定的數值才能準確[5] 。

2.2.2.2 消泡劑根據實際測量, 加不加消泡劑對測定值影響很大。若加入消泡劑, 則所測雙乙酰值會明顯增大, 這可能是消泡劑同時有促進雙乙酰前體物質轉化為雙乙酰的作用。

2.2.2.3 蒸餾在倒入酒樣進行蒸餾的時候, 蒸餾要迅速, 要在 3min 內蒸完。同一樣品隨蒸餾時間的延長, 其測定結果隨之升高。這主要與樣品中存在聯二酮類的前驅物質有關。在實際操作中常由于電爐功率大小、冷卻效果的好壞存在差異, 使實際蒸餾時間發生波動。當高溫時, α- 乙酰乳酸的非酶氧化速度很快, 時間不同, 它的轉化率也不相同, 造成了前驅物質存在數量不等的轉化, 這在半成品的測定時尤為突出[6] 。而且, 酒樣在存放中時間過長、蒸發器溫度過高, 也會引起雙乙酰揮發。蒸餾時有間隔, 使空氣進入蒸餾器中, 酒樣接觸空氣中的氧, 也影響測定數據的準確性。

2.2.2.4 顯色劑顯色劑鄰苯二胺是顯色反應的關鍵, 此藥一定要在暗處保存, 且不能超期存放, 否則, 試劑的顏色會變得發黃、發黑, 配制出的標準試劑會帶有顏色, 使測定結果偏高。所以配制此藥時一定要精心, 且當天配制, 當天使用。顯色劑鄰苯二胺加量以 0.5mL 為宜, 暗處反應時間可控制在 15～25min。

2.2.2.5 顯色溫度顯色反應速度與溫度有關。實驗表明, 隨著顯色溫度升高, 反應速度加快, 其顏色逐步加深, 吸光度增加, 會使測定結果偏高; 溫度過低, 反應不充分, 則會使測定結果偏低。這可能同參與顯色的物質成份有關。由于不同的環境、不同的季節溫度懸殊較大, 所以測定結果會有誤差。但國標中未對測定時的顯色溫度作出規定。

2.2.2.6 比色皿雙乙酰的測定選用波長為 335nm, 屬紫敏光源, 按儀器使用說明書, 在此波長下進行比色一定要使用石英比色皿, 若使用玻比色皿會使測定結果偏高。國標中未對比色皿的材質做出明確規定, 一些化驗室使用玻璃比色皿也可能造成一定的誤差。

3 提高測定結果準確度的建議 , 為使測定結果得到較高的準確度, 應經常校正分光光度計的靈敏度和波長精度, 并盡量控制被測溶液的吸光度接近于 0.2~0.8 的范圍。為此, 建議測定時使用 30mm 的石英比色皿。( 這時的雙乙酰含量按下式計算: X=A335×0.8。) 第二, 為了滿足反應要求, 要盡可能的選擇理想的測定方法, 取樣要準確。取樣前酒樣釋放的容量要適量, 酒樣存放的時間要短, 蒸餾要迅速, 并控制蒸餾時間在 3min 之內, 酒樣接觸空氣中氧的時間要盡量縮短, 得到 25mL 餾出液即可, 否則測定結果偏高。第三, 根據試驗結果, 蒸餾啤酒中雙乙酰時收集溫度以在室溫以下直接收集為宜。加不加消泡劑對測定值影響很大, 若加入消泡劑, 則所測雙乙酰值會明顯增大。第四, 嚴格按要求配制顯色劑等標準溶液。鑒于顯色溫度對測定結果會產生一定的影響, 建議將顯色溫度統一規定為 20℃(或 25℃)。顯色劑鄰苯二胺加量以 0.5mL 為宜, 暗處反應時間可控制在 15～25min。后, 儀器使用要正確, 操作要準確熟練。盡量減少各種操作誤差, 保證雙乙酰測定的準確度。

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