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紫外可見分光光度計(jì)測酶活性原理及過程

更新時(shí)間：2017-04-19 點(diǎn)擊次數(shù)：13268

紫外可見分光光度計(jì)測酶活性原理及過程

紫外可見分光光度計(jì)是利用物質(zhì)對光的選擇性吸收或發(fā)射的現(xiàn)象，通過測量不同波長的光能量變化（當(dāng)入射光強(qiáng)度一定時(shí)，介質(zhì)的吸光度于介質(zhì)中吸光物質(zhì)和介質(zhì)濃度的乘積成正比）而對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的儀器。被廣泛用于水質(zhì)，大氣，降雨，土壤，工業(yè)生產(chǎn)，藥

品檢驗(yàn)，污水檢驗(yàn)，香料，醫(yī)藥，疾控，人體化指標(biāo)分析，化妝品，金屬元素，無機(jī)鹽，海

洋地質(zhì)勘察，水廠，污水處理，農(nóng)藥殘留，作物成分，化肥檢測，土壤成分，植物保護(hù)，植

物檢疫，飼料檢測，動(dòng)物疾病預(yù)防，防腐劑等。

在食品行業(yè)中酶制劑是很好的保鮮添加劑，需要通過加熱等方法消除其不利影響。而紫外-可見分光光度法是研究酶性質(zhì)的重要方法之一,這次實(shí)驗(yàn)儀器使用的是UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計(jì)，產(chǎn)地上海，品牌奧析，生產(chǎn)廠家為光源燈使用全進(jìn)口光源，氘燈為濱松無臭氧環(huán)保型氘燈，可以減少操作者對臭氧的吸入（長期吸入臭氧對人體有害），鎢燈為德國歐士朗鎢燈，檢測器為美國派來茲，并且使用加厚光學(xué)底板，更加保證了儀器的穩(wěn)定性。

儀器的光度系統(tǒng)分成兩條光路，一條測試光路，一條參比光路。在參比窗口上放置一參照物；測試窗口則先后放置參比標(biāo)準(zhǔn)和待測樣品。

參比光路和參照物的作用是，監(jiān)測參比標(biāo)準(zhǔn)和待測樣品測量過程中光源能量波動(dòng)和電氣部分的漂移，計(jì)算機(jī)將兩次測量中的變化情況逐個(gè)記錄，在zui后計(jì)算時(shí)予以校正，因此雙光束紫外可見分光光度計(jì)的讀數(shù)值的準(zhǔn)確性更高。

操作步驟

在25℃ 4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4緩沖液中加入待測SOD樣液，再加入 10ul 50mmol/L的連苯三酚，迅速搖勻，倒人光徑lcm 的比色杯，在UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計(jì)325nm波長下每隔30s測一次A值。同時(shí)測定SOD標(biāo)準(zhǔn)品，對所測樣品SOD活性進(jìn)行校正。在lml反應(yīng)液中，每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量為一個(gè)酶活單位，即325nm 0.035OD/min為一個(gè)酶活單位，此種方法測超氧化物歧化酶。

0.1mL酶液與lmL 0.1 mol/L鄰苯二酚（用pH 8.4檸檬酸-磷酸緩沖液配制）80oC反應(yīng)3min，用2mL 20%TCA終止反應(yīng)，于波長450nm處用UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計(jì)測定吸收值。上述條件下，將每分鐘OD值增加0.01定義為1個(gè)酶活力單位，此種方法測多酚氧化酶

向具塞試管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液（用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3緩沖溶液配制，調(diào)節(jié)pH 10.0），于55℃水浴下保溫5 min，然后加入一定稀釋倍數(shù)的酶液0.2 mL反應(yīng)15 min，加入DNS試劑1.5 mL，混勻，在沸水中加熱10min，立即用自來水冷卻，再加入21.5 mL蒸餾水，混勻，于UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計(jì)上520 nm測定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代替。在上述試驗(yàn)條件下，以每分鐘分解底物產(chǎn)生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，此種方法測果膠酶。

用移液管將0.5 mL酶溶液移入試管，并在水浴中調(diào)溫至25℃。加0.5 mL已同樣預(yù)熱到25℃的1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS顯色劑。置試管于沸水中5 min，冷卻后用10 mL蒸餾水稀釋。用UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計(jì)于540 nm處以空白作對照測定吸光度。以0.5 mL磷酸鹽緩沖液代替酶液測定空白值。植酸酶以植酸鈉為底物，采用釩鉬酸銨法測定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸鈉（酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸鈉緩沖液配制）1.0 ml，37 oC預(yù)熱5 min后，準(zhǔn)確加入適當(dāng)稀釋的酶液0.5 ml（對照組先加反應(yīng)終止液），37 oC水浴反應(yīng)30min后，再加入4 ml反應(yīng)終止液（現(xiàn)用現(xiàn)配）冷卻至室溫，在415 nm處測定OD值，利用無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶活。在37℃，每分鐘從1 mmol/l植酸鈉溶液中（用pH值5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制）釋放出1 nmol無機(jī)磷所需要的酶量為一個(gè)酶活單位，此種方法測胰α-淀粉酶

在0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.625%的羧甲基纖維素鈉溶液，于50℃水浴中保溫30min，加2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液終止反應(yīng)，再加入2.5mLDNS試劑，于沸水浴中煮沸15min，冷卻，在UV1901PC雙光束紫外可見分光光度計(jì)550 nm波長處比色，要求光密度讀數(shù)盡可能在標(biāo)準(zhǔn)曲線的0. 5 mg葡萄糖處。每次測定均設(shè)立空白對照，對照管先加入0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液將酶滅活，再依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.625%的底物2. 0 mL，與待測管一起保溫，加入DNS，煮沸、冷卻、稀釋比色、與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照。在上述條件下，每30min產(chǎn)生0.5mg還原糖為1個(gè)Cx活力單位，即每1 h產(chǎn)生1.0mg還原糖為1個(gè)Cx活力單位，此種方法測羧甲基纖維素酶。

以木聚糖為底物，用DNS法測定還原糖的生成量。取稀釋酶液0.1ml，加 1%木聚糖液0.9ml，置50℃水浴保溫30min后，加DNS 2ml于沸水浴中顯色3min，用自來水冷卻后，加蒸餾水定容25ml，測O.D值，此種方法測木聚糖酶。每毫升酶液每分鐘水解木聚糖生成1μmol木糖所相當(dāng)?shù)拿噶俊?/span>

中性蛋白酶在一定的溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸，在堿性條件下，將福林試劑還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，其顏色深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過在660 nm測定其吸光度，可得到酶解產(chǎn)生的酚基氨基酸的量，計(jì)算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的總酶活力。取3支試管（一支空白管，兩支樣品管），分別向3支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測酶液1.0 mL，將3支試管放入40℃水浴中預(yù)熱5 min，同時(shí)將測定底物（1%酪素）置同一溫度水浴中預(yù)熱5 min。分別向兩只樣品管中加入1%酪素溶液1.0 mL，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10 min取出。迅速準(zhǔn)確向兩只樣品管加入0.4 mol/L三乙酸2mL，于空白管中加入0.4 mol/L三乙酸2 mL和1.0 mL 1%酪素溶液，搖勻。3支試管中反應(yīng)液用濾紙過濾。另取3支試管，分別吸取上述相應(yīng)濾出液1.0 mL，0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.0 mL和稀福林試劑1.0 mL，搖勻，置40℃水浴中放置20 min（顯色），取出，迅速冷卻置室溫。，在紫外可見分光光度計(jì)波長660 nm處分別測兩支樣品管吸光度，取平均值。通過查標(biāo)準(zhǔn)曲線求出生成酪氨酸的含量。

　α-淀粉酶在10 mL 試管中依次加入0. 5%可溶性淀粉溶液1 mL ， pH 4. 2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液2. 5 mL， 40 ℃預(yù)熱10 min。然后加入多倍稀釋的0. 5 mL 酶液， 40 ℃保溫5 min后，加入0. 1 mol/L H2 SO4 1 mL 終止反應(yīng)。再取2 mL 反應(yīng)液與0. 5% KI - I2 溶液0. 5 mL顯色，測定OD620。與淀粉梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得反應(yīng)液淀粉濃度后，計(jì)算酶活力。在pH 4. 2、溫度40 ℃下， 5 min水解可溶性淀粉1 mg所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

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